牛胚胎移植技术详解（牛受精卵移植技术）

[导读]牛胚胎移植技术是将优良遗传性状的母牛和公牛交配后的早期胚胎取出，移植到另1头生理状态相同的母牛子宫内，使...

胚胎移植也叫受精卵移植，是将优良遗传性状的母牛和公牛交配后的早期胚胎取出，移植到另1头生理状态相同的母牛子宫内，使其继续发育直到分娩。提供胚胎的母牛称为供体，接受胚胎的母牛称为受体。

胚胎移植技术主要包括供体牛的选择及饲养管理，超数排卵，人工授精，胚胎采集和质量鉴定，受体的选择及饲养管理，受体的同期发情和胚胎移植等环节。

该技术是继人工授精之后，牛繁殖技术的又一次革命，充分发挥了优秀母牛的遗传和繁殖潜力，大大增加了优秀母牛的群体数量。

我国牛胚胎移植研究和应用已有30多年的历史，已作为一项产业化技术在养牛业中广泛应用，为我国黄牛改良工作做出了重要贡献。

一、供、受体肉牛的选择

供体牛要有较高的生产性能，品种特征明显，体型外貌良好，遗传性能稳定，系谱清楚。

受体母牛一般选择本地黄牛、杂交牛及低产奶牛。供体牛年龄1.5～8岁为宜，从超排效果和便于冲胚考虑，最好选择1～1胎经产母牛。受体应选择年龄在8岁以内的性成熟母牛，青年母牛要选择体成熟并且体格较大的。

供、受体母牛都要求健康无病，繁殖机能正常，没有流产史，产后60天以上，发情周期正常。直肠检查子宫及卵巢发育正常，无生殖系统疾病。

母牛体格较大、膘情中等以上、性情温顺。长期空怀、子宫颈狭窄等不得作供、受体母牛。

二、饲养管理

营养是影响母牛繁殖能力的主要因素，供、受体牛都要加强饲养管理，保证足够的优质青粗饲料、精料以及维生素、矿物质等，保证清洁饮水。

农村散养牛，可采取集中统一管理方式（1-2个月），加强饲养管理。

三、供体牛超数排卵处理方法

超排药品主要有促卵泡素( FSH)、氯前列烯醇(PG)或阴道栓(CIDR)等。超排过程中供体母牛在发情后的第9～13天，连续4天早晚间隔12小时肌肉注射FSH，在注射FSH的第3天用PG处理。

在实际应用时，一般是同时处理多头供体和受体母牛，为达到同期化，常采用以下两种方法。

两次PG+FSH法：

以国产PG和FSH为例，供体母牛在第1次肌肉注射4毫升PG后，问隔10天再次注射4毫升PG。在第2次肌肉注射PG后的第14天开始进行超排处理。

FSH采用递减法连续4天早晚间隔12小时进行注射，4天注射量分别70国际单位/70国际单位、60国际单位/60国际单位、50国际单位/50国际单位、40国际单位/40国际单位，总量为440国际单位。在注射FSH的第3天，同时注射PG。注射PG后第2天（注射当天为0天），早晚各输精1次，第3天视牛的发情状况，再输精1次。

CIDR+FSH法：

以进口药物为例，供体母牛在第1天植入CIDR，在第11天开始注射FSH。采用的是递减法，连续4天早晚间隔12小时注射，4天注射量分别为4毫升肉牛胚胎移植技术／4毫升、3毫升／3毫升、2毫升／2毫升、l毫升／1毫升。在第3天注射FSH的同时，上下午各注射1.5毫升PG，在第4天上午注射FSH时取出CIDR，注射PG后的第2天（注射当灭为0天）上午、下午各输精1次。再次输精与否视母牛的发情状况而定。

四、冲胚程序

1、冲胚时间：在发情配种后的第7天（发情当天为0天）冲胚，也可在第6天或第8天冲胚。

2、保定与麻醉：供体牛按照人上授精的要求进行保定，并用2%的普鲁卡因5 - 10毫升作尾椎硬膜外麻醉。

3、器械和冲胚液的准备

所有器械必须严格按无菌要求进行消毒，在清洗的最后一定要用双蒸水冲洗，接触胚胎的器械容器要用冲卵液进行冲洗；冲胚前冲卵液要先预热（水浴锅或热水浸泡）到35 - 37℃。

4、超排效果检查：在冲胚前，通过直肠检查卵巢黄体个数，可判断能冲出的胚胎个数。

5、操作步骤

①用清洁温水清洗外阴后，用消毒毛巾或卫生纸擦干净。一般不用消毒药水，因其使用不当反而会对胚胎造成伤害。

②用扩张棒打开子宫颈通道后退出。

③用冲卵液内外冲洗冲卵管，并检查气球是否完好后装入钢芯。

④采用直肠把握法将冲卵管插入阴道，通过子宫颈将冲卵管插到一侧子宫角（左或右），当到达子宫角大弯部位时，将钢芯退出约3厘米，并把冲卵管继续向前推进，如此反复，直到冲卵管前端到达子宫角深部。由助手用注射器冲卵管冲气孔注入9 - 18毫升（根据子宫角大小确定）空气使气球膨胀，堵住子宫角，关闭进气孔后，将通针取出开始冲胚。

⑤助手用注射器吸取冲卵液，每次15 - 30毫升，从冲卵管L]推入子宫角，注入冲卵液后术者用直肠中的手将子宫角抬高，冲卵液体就会同流，用瓶子接住或直接用注射器回收即可。一般一侧子宫角反复冲7次左右。

⑥如需冲另一侧子宫角，则按③④⑤重复操作即可。

⑦冲胚时每头牛用一个容器（瓶子或滤杯）装回收液，并要注意保温和避免污染。

6、术后处理

两侧子宫冲卵完毕后，将气球内的空气放掉，把冲卵管抽回至子宫体，直接从冲卵管灌注青霉素80万单位、链霉素100万单位和氯前列烯醇4毫升（用双蒸水或生理盐水稀释）。

五、检胚

1、检胚前的准备

检胚实验室及各种器具要事先消毒，检胚的室温要求是25℃，如果气温低要提前进行升温。

2、过滤法回收

将回收的冲卵液直接注入过滤杯，将过滤杯中留下的35毫升左右回收液倒入平皿中，用冲卵液冲洗过滤杯2-3次，其液体一并冲入平皿中，然后在体视显微镜下检胚。

3、沉淀法回收

回收液静置20分钟后用塑料管吸去上清液，在吸时根据虹吸原理进行，要控制（用手握紧或放松出水口）液体的流速，使其缓慢流出，并注意把上面的气泡吸尽，当吸到液面还有2～2.5厘米深时，将余下的液体倒入两个培养皿中镜检。

4、检胚

在体视显微镜6×1.5倍进行榆胚。用自制的玻璃微吸管（玻璃管拉丝，后面配上一节封口的塑料管）吸取少量培养液将胚胎吸出，移入装有培养液的平皿中。

六、胚胎的质量鉴定和分级

1、放大倍数

胚胎质量鉴定一般在放大60～200倍体视显微镜下进行，如果受体视显微镜放大倍数的限制，30倍也行。

2、鉴定依据

在显微镜下根据胚胎分裂与否、形态色调、分裂球大小、均匀度、细胞的密度、透明带以及变性情况等鉴定。

①未受精卵。没有分裂球及细胞团的卵子。

②桑葚胚。发情后5～6天冲出的卵，只能观察到球状的细胞团，分不清分裂球。细胞团占据透明带内腔的大部分。

③致密桑葚胚。发情后第6～7天回收的卵，细胞团变小，占透明带内腔的60％ - 70%。

④早期囊胚。发情后第7-8天冲出的卵，细胞的一部分出现发亮的胚泡腔。细胞团占透明内腔的70% - 80%，难以分清内细胞团和滋养层。

⑤囊胚。发情后第7-8天回收的胚胎，内细胞团和滋养层界线清晰，胚泡腔明显，细胞充满透明带内腔。

⑥扩张囊胚。发情后第8-9天回收的胚胎，胚泡腔明显扩大，体积增大到原来的1.2 -1 5倍，与透明带之间无空隙，透明带变薄，相当于正常厚度的1/3。

⑦孵育胚。在发情后第9 - 11天回收的胚胎，由于胚泡腔继续扩张，致使透明带破裂，卵细胞脱出。

3、胚胎的分级

冲出的胚胎一般分为A、B、C、D4级。

A级：胚胎形态完整，轮廓清晰呈球形，分裂球大小均匀，结构紧凑，色调和透明度适中，无附着的细胞和液泡。
B级：轮廓清晰，色调及细胞密度良好，可见到一些附着的细胞和液泡。
C级：轮廓不清，色调发暗，结构较松散，游离的细胞或液体较多，变性的细胞达30％ - 50%。
D级：未受精卵、16细胞以下受精卵、有碎片的退化卵及变性细胞超过一半的胚胎。

A级、B级、C级胚胎为可用胚胎，其中，A级、B级为可冷冻胚胎，C级胚胎只能用于鲜胚移植，D级胚胎为不可用胚胎。

七、鲜胚移植

供、受体牛经过同期发情处理，从供体牛获得的胚胎可以马卜移植到受体牛的子宫内。

1、受体牛的同期化处理

受体牛的同期化是指其发情时间与供体牛基本一致，相差时间最好提前一天，受体牛处理头数一般为供体牛的5倍。

(1)前列腺素法

一次前列腺素(PG)法：在供体牛用前列腺素的前l天，对处于发情周期第10天的受体牛进行直肠检查，选择黄体好的受体牛一次肌肉注射前列腺素2～4毫升（按牛体重大小）诱导发情，发情后第7天进行移植。

二次前列腺素(PG)法：对经直肠检查空怀的受体牛注射一次前列腺素2-4毫升后11天再次肌肉注射前列腺素2-4毫升，发情后第7天进行移植。

(2)阴道栓加前列腺素(CIDR+PG)法

在供体母牛放入CIDR的第3天，给受体母牛放置CIDR，10天左右取出CIDR，同时肌肉注射PG 4毫升，发情后第7天进行移植。

2、胚胎冲洗

在移植前要对胚胎进行冲洗，方法是在一个培养皿中，分别滴10～12滴培养液，每滴0 l毫升左右，用玻璃微吸管吸入培养液，挤出少量培养液后，按前述的方法从培养液中取出胚胎放入第一滴培养液中，排空吸管，从第二滴培养液中吸入培养液，挤出少量培养液，从第一滴中吸出胚胎放入第二滴培养液中，如此反复直到最后·滴冲洗完毕。

3、装细管及输胚器（枪）

用0. 25毫升的塑料细管，先吸入约2厘米长度的培养液，荐吸入l厘米长度的空气，再吸入胚胎，再吸入空气，再吸入培养液，细管的两头要留有空气间隔（即7段装胚法），整个过程用微型注射器吸入。输胚器的安装基本与细管精液输精枪相同，但要特别注意无菌操作，手不能直接触摸枪帽。装好后要注意保温和避免污染，一般用灭菌卫生纸或纱布包裹头部，并要尽快输入受体牛子宫。

4、合理搭配受体和胚胎

对受体牛移植时，要考虑胚胎的发育情况和受体的发情时间。一般处于发情第6天的受体牛选用致密桑葚胚移植，处于发情第7天的受体牛选用早期囊胚移植，处于发情第8天的受体牛选用囊胚或扩张囊胚移植。

5、输胚

受体牛有两种来源，一是用同期化处理的受体牛，二是根据自然发情记录来确定。不管是哪一种方法在输胚前都必须确定受体牛处于发情周期的第7天(6 -8天)，并通过直肠检查卵巢上是否有明显的黄体存在，只有明确了黄体的存在并发育正常，才能进行输胚，而且胚胎必须输在有黄体一侧的子宫角深处。操作方法基本同人工授精，不同的是输胚的部位在有黄体侧的子宫角深部。要尽量减少对子宫的刺激，避免子宫受伤，操作最好在3分钟内完成。

八、胚胎冷冻与解冻

一般在专门生产胚胎或进行鲜胚移植获得的可用胚多于受体牛时可将胚胎冷冻保存。下面以乙二醇为冷冻保护液的冷冻过程如下。

1、装管万法

将冲洗过的胚胎装入0. 25毫升的细管中。过程如下：用微型注射器连接细管，吸入约2.5厘米保存液-0.5厘米空气-0.5厘米冷冻液-0.5厘米空气一含一枚胚胎的冷冻液-0.5厘米空气-0.5厘米冷冻液-0.5厘米宅气一适量保存液，最后用细管封口塞封口。一般要制作一个标签，注明胚胎系谱、冷冻方法、胚胎发育期及级别等。

2、冷冻程序

用白动或半自动胚胎冷冻仪进行胚胎冷冻。程序如下：将胚胎冷冻仪的冷冻室预冷至5.5℃（植冰温度），将装有胚胎的细管放入冷冻室平衡5 -10分钟，植冰，再平衡5- 10分钟，然后以每分钟0.3℃的降温速度降温至-32℃，平衡10分钟后，将细管投入液氮保存。

3、冻胚解冻

用乙二醇为冷冻保护液制作的冷冻胚胎，解冻后可直接移植。解冻程序是：从液氮中取出装有胚胎的细管一置于空气中10秒一放入35℃温水中10秒一灭菌棉擦干一拧下细管塞一装入移植枪。

九、妊娠诊断

在受体牛接受移植后2个月，通过直肠检查法判断是否妊娠。